ساخت و کلونینگ ‏‎cdna‎‏ فاکتور محرکه کلنی گرانولوسیت انسانی ‏‎(hg-csf)‎‏

فاکتور محرکه کلنی گرانولوسیت انسانی ‏‎(hg-csf)‎‏ یکی ازفاکتورهای رشد خونساز می باشد که تکثیر و تمایز سلول های پیش ساز گرانولوسیت نوتروفیلی و تشکیل کلنی نوتروفیلی سلولهای مغز استخوان را تحریک می کند. این فاکتور همچنین تمایز نهایی بعضی از سلول های لوسمی میلوئیدی را القا می کند. ‏‎hg-csf‎‏ در منوسیت ها و ماکروفاژهای انسانی در پاسخ به آندوتوکسین باکتریایی، و همچنین در رده های سلولی انسانی نظیر کارسینوهای حفره دهانی ‏‎chu-2‎‏ و کارسینومای مثانه 5637، تولید می شود.هدف از انجام این پژوهش، استخراج ‏‎rna‎‏ کل از سلول های منوسیت انسانی تحریک شده، سنتز ‏‎hg-csf dscdna‎‏ و در نهایت کلون کردن ‏‎cdna‎‏ سنتز شده در یک ناقل کلونینگ مناسب می باشد. در ابتدا، سلول های منوسیت از خون محیطی فرد طبیعی جداسازی شد. این سلول ها کشت داده شده و به طو همزمان به وسیله محرکهای لیپوپلی ساکارید باکتریایی ‏‎(lps)‎‏ و اینترفرون گامای انسانی (لاندا ‏‎hifn-‎‏ )تحریک شد. ‏‎rna‎‏ کل از سلول ها استخراج شد و به دنبال آن ‏‎cdna‎‏ دارای ترادف راهنما (کدکننده پروتئین اولیه) و ‏‎cdna‎‏ فاقد ترادف راهنمایی (کد کننده پروتئین بالغ) ‏‎hg-csf‎‏ با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و بر اساس روش ‏‎rt-pcr‎‏ سنتز شد. همچنین هر دو ‏‎cdna‎‏ مذکور به طور همزمان از ‏‎rna‎‏ کل استخراج شده ازسلول های کارسینو مای مثانه انسانی 5637 سنتز شد. در مرحله بعدی هر دو ‏‎cnda‎‏ منوسیتی فاقد و دارای ترادف راهنما با استفاده از آنزیم محدودگر ‏‎styi‎‏ که بر روی ژل الکتروفورز تشکیل سه قطعه مجزا می دهد، مورد تایید قرار گرفت. سپس ‏‎cdna‎‏ دارای ترادف راهنما درون ناقل کلونینگ ‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎e.coli‎‏ (سویه ‏‎(top10f‎‏ کلون شد. به دنبال غربالگری، کلنی های صحیح انتخاب شد و ناقل نوترکیب از باکتری های ترانسفورم شده، استخراج شد و با استفاده از آنزیم های محدودگر ‏‎bamhi, ecori, styi, ncoi‎‏ تایید شد. برای تایید نهایی، ناقل نوترکیب واجد اینسرت صحیح انتخاب و تعیین توالی ‏‎(sequencing)‎‏ شد. بعد از تایید ترادف نوکلئوتیدی ‏‎cdna‎‏ کلون شده، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناقل نوترکیب به عنوان الگو، و با کمک ‏‎cdna, pcr‎‏ فاقد ترادف راهنما سنتز و در ناقل کلونینگ ‏‎‏‎‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎e.coli‎‏ (سویه ‏‎top10f‎‏) کلون شد. به دنبال غربالگری، کلنی های صحیح انتخاب شد و ناقل نوترکیب از باکتری ها ترانسفورم شده، استخراج شد و با استفاده از آنزیم های محدودگر ‏‎bamhi, ecori, styi, ncoi‎‏ تایید شد. تایید نهایی، ناقل نوترکیب واجد اینسرت صحیح انتخاب و تعیین توالی ‏‎(sequencing)‎‏ شد. بعد ازتایید ترادف نوکلئوتیدی ‏‎cdna‎‏ کلون شده، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناقل نوترکیب به عنوان الگو، و با کمک ‏‎cdna, pcr‎‏ فاقد ترادف راهنما سنتز و در ناقل کلونینگ ‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎top10f‎‏ کلون شد. در نهایت کلون صحیح انتخاب و با استفاده از آنزیم محدودگر مورد تایید قرار گرفت.